SUMO简介

SUMO标签氨基酸序列

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MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG

其中，SUMO切割位点在两个甘氨酸（GG）之后，使用SUMO标签融合表达目的蛋白时，通常SUMO位于N端，目的蛋白在SUMO的C端连接。

氨基酸数量：98

分子量：11.261 kDa

等电点：4.92

SUMO 融合基因表达系统

原核基因融合表达系统有，NusA,MBP,TRX,GST等，这些系统都有各自有其优势，也有其缺陷，如表达水平不足或因特定的结构造成标签切割不完全。

SUMO优点：

1. SUMO促溶效果与MBP/NusA相当，但自身分子量较小，11kDa左右，而MBP为42kDa，NusA为55kDa，因此，融合表达蛋白对宿主代谢系统的负担，SUMO要小许多。
2. SUMO标签切除依靠SUMO Protease的立体结构性识别，而其它标签则需依赖在标签与目的蛋白之间插入特定的识别氨基酸序列，如TEV、HRV-3C Protease识别序列等，且由于目的蛋白多样性，切割效率有可能受到蛋白结构空间位阻的影响而变化。
3. SUMO Protease能比其他蛋白酶耐受更高的常见缓冲液化学成分。这为后续标签切除，蛋白质精纯提供了便利。如，从Ni-NTA洗脱得到的含高浓度咪唑的目的蛋白溶液可直接加入SUMO Protease进行切割，而使用其它蛋白酶可能需要先进行脱盐或者超滤换液后再进行酶切。
4. （本优点为MP个人经验）SUMO-Protease可以较高水平的原核表达，且仅Ni柱纯化就能达到较高的纯度，降低了使用该系统的成本。另外，SUMO较低的等电点（pI 4.92），或称之为酸性蛋白，在后续切割标签之后若使用离子交换纯化，可能会有优势。

    SUMO融合表达系统有什么缺点呢？

高耐受性：

蛋白质纯化过程中常用的化学物质，如NaCl,咪唑，盐酸胍，尿素，Triton X-100等，SUMO Protease耐受均较高。

各种化学物质对SUMO Protease（ULP1）活性的影响

高效切割

20种氨基酸测试

将SUMO-GFR蛋白中GFP首个氨基酸甲硫氨酸改为其它19种氨基酸，以验证G-G-(X)的切割效率影响，实验证20种氨基酸中，仅仅脯氨酸（P）影响SUMO Protease切割。

这一特性对某些需要在N-端暴露特定氨基酸的蛋白质十分有用。

SUMO Protease(ULP1）表达与纯化

质粒：pET28a-6His-ULP1（Catascis Biotech）

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMENLYFQGLVPELNEKDDDQVQKALASRENTQLMNRDNIEITVRDFKTLAPRRWLNDTIIEFFMKYIEKSTPNTVAFNSFFYTNLSERGYQGVRRWMKRKKTQIDKLDKIFTPINLNQSHWALGIIDLKKKTIGYVDSLSNGPNAMSFAILTDLQKYVMEESKHTIGEDFDLIHLDCPQQPNGYDCGIYVCMNTLYGSADAPLDFDYKDAIRMRRFIAHLILTDALK*

N-6His，含TEV Protease酶切位点。

MW:28.6 kDa

pI:6.83

转化与培养：

1. 取pET28a-ULP1转化BL21(DE3)。涂布Kan抗性平板，37℃倒置过夜培养。
2. 第二天挑取单菌落，液体培养。转接50-100mL摇瓶。
3. 以1%接种量，转接2-4个含1L TB培养基的大摇瓶。37℃，200rpm培养
4. OD600至0.6，加入终浓度0.5 mM IPTG.
5. 37℃继续培养3小时。或30℃培养4-6小时。
6. 5000rpm离心10 min收集菌体，-80℃保存。

纯化：

1. 以1g-10mL的体积使用NPI-10悬浮细胞。加入终浓度 1 mM PMSF。
2. 超声破碎。
3. 14000rpm 离心30min。取上清，以0.2 um滤膜过滤后，使用HisTrap  HP  5mL进行纯化。
4. 线性梯度洗脱，大约100mM咪唑洗下目的蛋白。

5. 根据后续使用目的，使用Superdex 75分子筛柱进行精纯。

参考文献：

1. SUMO Gene Fusion Technology,White Paper.LifeSensers Inc.2004

2. US Patent:US7220576

3. SUMO fusion technology for enhanced protein production in prockaryotic and eukaryotic expression systems.

4. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.

5. A simple and rapid protein purification method based on cell‑surface display of SUMO‑fused recombinant protein and Ulp1 protease.

6. Efficient Expression of SUMO Protease Ulp1and Used to Express and Purified scFv by His-SUMO tag.