地衣芽孢杆菌的感受态制备及电转化

1．在20 mL LB培养基中接种一环B. licheniformis，37 °C，200 rpm过夜培养12 h；

2．取2 mL过夜培养液接入50 mL 生长培养基中，于37 °C，200 rpm培养至对数中后期，直到细胞 OD₆₀₀达到0.85~1.05；

生长培养基（g L^-1）：胰蛋白胨10，酵母粉5，山梨醇91.1，NaCl 10。灭菌条件为121 °C，20 min。

（以下步骤中所用到的枪头均需提前预冷，且都在冰上操作）

3．取2 mL EP管，每管加入2 mL菌液，冰浴30 min，停止生长后，再于4 °C、6000 rpm离5 min收获细胞；

4．离心后的菌体每管加入冰冷（0 °C冰水浴）的EP缓冲液1 mL，轻轻吹打，悬浮细胞，4 °C、6000 rpm 离心8 min，用枪吸出上清液；

EP缓冲液：EP缓冲液(L^-1)：山梨醇91.1 g，甘露醇91.1 g，甘油100 mL。灭菌条件为121 °C，20 min。

5．每管重新加入冰冷的EP缓冲液1 mL，轻轻吹打，悬浮细胞，此步骤可将2管菌悬液合并为1管，4 °C、6000 rpm 离心8 min，用枪吸出上清液；,

6．每管再重新加入冰冷的EP缓冲液1 mL，轻轻吹打，悬浮细胞， 4 °C、6000 rpm 离心8 min，用枪吸出上清液；

7. 每管再重新加入冰冷的EP缓冲液1 mL，轻轻吹打，悬浮细胞， 4 °C、6000 rpm 离心8 min，用枪吸出上清液，最后再加入100 uL EP缓冲液，即制得地衣芽孢杆菌感受态，可立即使用，也可-80度保存；

8. 每管感受态细胞中加入1 ug质粒，轻弹混匀，转移至预冷的0.1 cm电击杯中，冰上静置1h；

9．以2500 V、4 ms脉冲转化；

10．迅速往电击池中加入1 mL复苏培养基，将菌悬液回收到5 mL离心管中，于37 °C，200 rpm培养5 h；

复苏培养基（g L^-1）：胰蛋白胨10，酵母粉5，山梨醇91.1，甘露醇69.2 ，NaCl 10。灭菌条件为121 °C，20 min。

11．将菌液涂布于抗性的LB固体培养基平板上，于37 °C培养直到平板上出现单菌落。