细胞毒素焕发新活力：一种可应用于纳米孔技术、疫苗开发和肿瘤治疗的细菌毒力因子ClyA

上世纪90年代，Ludwig研究团队首次发现：在大肠埃希氏菌K-12菌株中过表达伤寒沙门氏菌调控蛋白SlyA会导致合成一种新的细胞溶解素ClyA，使重组大肠埃希氏菌表现出溶血表型。ClyA是一种34kDa的孔道形成毒素，可由包括大肠杆菌和沙门氏菌在内的某些肠杆菌科细菌产生[1]。

自ClyA被发现以来，许多研究对它的结构、功能以及毒力作用进行了探索。ClyA在细菌胞内合成可溶性单体后，通过外膜囊泡转运至胞外，在经历大规模构象变化后在宿主细胞膜上形成环状复合物跨膜孔道（图1），从而造成宿主细胞的溶解和凋亡。

                  图1：ClyA分泌及孔组装途径

ClyA在细菌毒力方面起着重要作用，同时，近年研究表明ClyA在生物技术应用方面也存在巨大的潜力。这一“古老”的毒素蛋白在纳米孔技术、疫苗开发和肿瘤治疗方面焕发了新的活力。孔道毒素可形成蛋白通道的结构性质使其被广泛应用于生物学“纳米孔”系统，实现无需标记、化学修饰或表面固定的单分子分析。Maglia研究团队首次证明了ClyA在其纳孔腔内可以容纳原生态折叠的蛋白质。随后的研究报告进一步证实了ClyA在作为检测单个大分子的生物纳孔方面的实用性[2]。ClyA还被应用于开发无电极纳米孔传感方法，可以在无电的情况下对单分子进行光学监测。

ClyA通过外膜囊泡（OMVs）介导的分泌方式使其成为将外源蛋白或抗原传递到OMVs的理想融合蛋白和支架，使目标蛋白或抗原能够成功展示在释放的OMVs表面。目前，工程化的ClyA-OMV系统已应用于开发多种病原体疫苗。当把完整的鲍曼不动杆菌Omp22蛋白与ClyA融合后展示在大肠埃希氏菌OMVs表面。接种工程化的OMVs可以诱导小鼠产生抗原特异性体液免疫应答，从而产生免疫保护。此外，Yang研究团队报道了携带ClyA和SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）融合蛋白的细菌仿生囊泡（BBV），并将这一系统与高压均质技术相结合进一步增强了RBD在BBV上的展示以及RBD-BBV的产量；在皮下注射RBD-BBV使其积聚在淋巴结中，促进抗原的吸收和处理，从而引发小鼠对SARS-CoV-2的特异性体液和细胞免疫应答[3]。

在肿瘤治疗方面，Ryan等人首次证明了融合了缺氧诱导启动子的ClyA可增强肿瘤缺氧区域的坏死，并可抑制小鼠肿瘤生长[4]。另一项研究使用ClyA-OMV系统成功实现了程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）外域的展示。工程化的OMVs结合在肿瘤细胞表面的PD-1配体1上，从而促进PD-1配体1的内化，并降低其在肿瘤细胞上的表达水平。Thomas等人的最新研究显示，透明质酸酶（Hy）通过ClyA锚定在OMVs表面，使Hy更有效、更均匀地在肿瘤内分布，促使药物渗透并通过大幅降低肿瘤组织中透明质酸水平来增强药效。这些结果表明ClyA-OMV系统可能是进行基质重塑、溶细胞疗法以及提高抗癌靶向治疗活性的有效工具。

参考文献：

1.Ludwig, A.; Tengel, C.; Bauer, S.; Bubert, A.; Benz, R.; Mollenkopf, H.J.; Goebel, W. SlyA, a regulatory protein from Salmonella typhimurium, induces a haemolytic and pore-forming protein in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 1995, 249, 474–486.

2.Franceschini, L.; Brouns, T.; Willems, K.; Carlon, E.; Maglia, G. DNA Translocation through Nanopores at Physiological Ionic

Strengths Requires Precise Nanoscale Engineering. ACS Nano 2016, 10, 8394–8402.

3.Huang, W.; Wang, S.; Yao, Y.; Xia, Y.; Yang, X.; Li, K.; Sun, P.; Liu, C.; Sun, W.; Bai, H.; et al. Employing Escherichia coli-derived

outer membrane vesicles as an antigen delivery platform elicits protective immunity against Acinetobacter baumannii infection. Sci.

Rep. 2016, 6, 37242.

4.Ryan, R.M.; Green, J.; Williams, P.J.; Tazzyman, S.; Hunt, S.; Harmey, J.H.; Kehoe, S.C.; Lewis, C.E. Bacterial delivery of a novel cytolysin to hypoxic areas of solid tumors. Gene Ther. 2009, 16, 329–339.