N-乙酰神经氨酸（Neu Ac）是最常见的分布最广的一种唾液酸（SA），占据细胞膜中糖蛋白、糖脂或寡糖的末端位置，在生物学、病理学和免疫学过程中发挥重要作用。同时 Neu Ac 也是母乳寡糖中重要的单糖组成单元，具有促进婴儿大脑发育和增强免疫力等功效。另外 Neu Ac 的衍生物可以作为抗癌、抗粘连和抗病毒药物，也能作为医药治疗中的纳米载体特异性的进行疾病治疗。Neu Ac 在食用和药用方面的增长需求，对Neu Ac 的制备方法提出了更高的要求。然而，传统提取、化学法和发酵法合成 Neu Ac 的较低产量和生产效率以及环境污染限制了 Neu Ac 的供应，同时目前全细胞转化法的宿主是大肠杆菌（Escherichia coli），Neu Ac 合成存在的潜在内毒素污染风险不利于 Neu Ac在食品和医药方面的应用。在本课题中，我们开发了一种利用食品级安全级菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）全细胞转化生产 Neu Ac 的方法。主要研究内容如下：

 

（1）首先克隆来自鱼腥藻（Anabaena sp. CH1）编码 N-乙酰葡萄糖胺 2-差向异构酶（AGE）的基因 age 和来自大肠杆菌（E. coli K12）编码 Neu Ac 醛缩酶（Nan A）的基因 nan A 至表达载体 pP43NMK，在枯草芽孢杆菌中构建以 N-乙酰葡萄糖胺（Glc NAc）和丙酮酸为底物合成 Neu Ac 的异源途径。之后比较了 7 种不同强度的组成型启动子调控 AGE 和 Nan A 表达，构建得到一系列不同表达强度的重组质粒，以强启动子 P43 调控AGE 和 Nan A 表达的重组菌 B6CG/p43AN 进行全细胞转化，以 1.2 mol·L-1丙酮酸和 0.4 mol·L-1 Glc NAc 为底物反应 48 h 得到 32.84 gL-1 Neu Ac，其中 Glc NAc 的摩尔转化率为26.55%。

 

（2）为了进一步寻找更优来源的 nan A 基因，比较了来自大肠杆菌（E. coli K12）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium. glutamicum ATCC13869）和葡萄球菌（Staphylococcus. hominis EFS20452.1）来源的 nan A 对全细胞转化合成 Neu Ac 的影响。全细胞转化实验结果表明，当采用来源于 S. hominis 的 shnan A 时，重组菌 B6CG/p43ANsh 全细胞转化的 Neu Ac 产量达到 46.04 gL-1，相对于表达 E. coli K12 来源的 nan A 时提高了 40.2%。

 

（3）为了提高 Neu Ac 醛缩酶（Sh Nan A）的表达水平，筛选 10 种枯草芽孢杆菌高表达蛋白的编码基因的 N-端编码序列，并且将 N-端编码序列融合于 shnan A 的 5-末端调控 shnan A 表达。通过比较不同 N-端编码序列融合于 shnan A 对重组 B. subtilis 全细胞转化合成 Neu Ac 的影响，筛选得到一种有效促进 shnan A 表达和活性的 N-端编码序列N1-tuf A，重组菌 B6CG/p43ANsh N1-tuf A 的 shnan A 表达由 N-端编码序列 N1-tuf A 调控，全细胞转化 Neu Ac 产量达到 56.82 gL-1。

 

（4）通过敲除 als S 和 als D 基因阻断丙酮酸转化为副产物乙偶姻的代谢途径，阻断B. subtilis 自身对底物丙酮酸的消耗问题，得到的重组菌 B6CGSD/p43ANsh N1-tuf A，全细胞转化 Neu Ac 达到 68.75 gL-1，其中 Glc NAc 的摩尔转化率为 55.57%。最后对重组菌B6CGSD/p43ANsh N1-tuf A 进行菌体培养时间和全细胞转化条件的优化，包括 p H、温度、表面活性剂种类和浓度、菌体浓度和底物浓度。最终 Neu Ac 产量提高了 36.41%，达到93.78 gL-1，Glc NAc 

的转化率为 50.54%。