产品介绍

大肠杆菌BW29427（Escherichia coli BW29427）是一种基因工程改造的菌株，属于PIR系列菌株，主要用于λ-Red重组系统和接合转移实验，具有利福平耐药（RifR）、二氨基庚二酸营养缺陷（DAP⁻）等特征。该菌株是构建基因敲除、基因整合等遗传操作的常用工具菌。

一、核心基因型与特征

完整基因型：F⁻, Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ⁻, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514, ΔasdA4::(erm-pir), recA1, RifR

关键特征解析：

• ΔasdA4::(erm-pir)：asd基因缺失（DAP营养缺陷），同时整合了pir基因（表达π蛋白）和红霉素抗性标记（erm）

• pir基因表达：可复制依赖π蛋白的质粒（如pKD系列、pCP系列等R6K复制子质粒）

• DAP缺陷：需在培养基中添加二氨基庚二酸（DAP，50μg/mL）才能生长

• 利福平耐药（RifR）：rpoB基因突变，耐受利福平（筛选浓度通常2500μg/mL）

• recA1：重组缺陷，提高遗传稳定性

• hsdR514：限制系统缺陷，便于外源DNA转化

二、主要应用场景

1. λ-Red重组系统（基因敲除/整合）

BW29427是PIR菌株，可复制R6K复制子质粒（如pKD46、pKD3等），配合λ-Red重组酶系统，用于：

• 基因敲除：通过同源重组替换靶基因

• 基因整合：将外源片段整合到基因组特定位置

• 点突变引入：精确编辑特定碱基

2. 接合转移实验（供体菌）

BW29427常作为接合转移的受体菌，与携带R6K质粒的供体菌（如S17-1λpir）进行接合，实现质粒转移。其DAP缺陷和利福平耐药可作为筛选标记。

3. 其他应用

• 构建基因文库

• 重组蛋白表达（需导入表达质粒）

• 代谢工程研究

三、培养条件与操作要点

培养基要求

• 基础培养基：LB培养基

• 必需添加物：DAP（50μg/mL，用于维持生长）

• 筛选抗生素：

  • 利福平（2500μg/mL，维持菌株）

  • 红霉素（150μg/mL，筛选pir⁺克隆）

  • 其他抗生素（根据实验需求，如氨苄、卡那等）

培养条件

• 温度：30℃或37℃（λ-Red诱导时需30℃）

• 诱导条件：如需表达λ-Red重组酶（pKD46质粒），需添加L-阿拉伯糖（0.1-0.2%）

• 保存：-80℃甘油保存

操作注意事项

1. DAP依赖性：无DAP时菌株会裂解死亡，转化或接合后需在含DAP平板上筛选

2. 质粒兼容性：只能复制R6K复制子质粒（需pir蛋白），普通pUC、pET等质粒无法复制

3. 转化效率：电转化效率较高，化学转化效率相对较低

4. 菌株验证：建议通过PCR验证asd缺失和pir表达状态

四、常见问题与解决方案

五、重要说明

1. 菌株来源：BW29427由耶鲁大学实验室构建，可从ATCC或相关生物公司购买

2. 与类似菌株区别：

   • BW29427 vs BW29426：两者基因型相似，但BW29426为DAP⁺（asd⁺），可用于不同筛选策略

   • PIR菌株系列：还有S17-1λpir、SM10λpir等，但BW29427的DAP缺陷特性使其在接合转移中筛选更严格

3. 安全等级：BSL-1级，常规实验室操作即可

4. 应用限制：因DAP缺陷和recA突变，不适用于某些代谢工程或需要高重组效率的场景

总结：BW29427是λ-Red重组系统和接合转移实验的重要工具菌株，其DAP缺陷和pir表达特性使其在无抗生素筛选和质粒稳定维持方面具有优势。使用时需注意培养基补充DAP、质粒兼容性以及温度控制等关键条件。

基本信息